روش های تشخیص میکروارگانیسم ها

دکتر منصور بیات(استاد قارچ شناسی دانشگاه آزاد اسلامی) – اشکان حاج جعفری(پژوهشگر آزاد)

روش های سنتی

روش‌های سنتی تشخیص میکروارگانیسم‌ها مانند بررسی مستقیم، کشت و تکنیک‌های ایمونولوژیکی از گذشته تا به امروز در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی مورد استفاده قرار گرفته‌اند. معاینه مستقیم شامل مشاهده میکروسکوپی میکروارگانیسم ها در نمونه های بالینی است که نتایج اولیه سریع را ارائه می دهد. کشت، شامل رشد میکروارگانیسم ها در محیط های خاص است که بسته به ارگانیسم ممکن است یک یا چند روز طول بکشد. روش‌های ایمونولوژیک، آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌های خاصی را شناسایی می‌کنند که نتایج سریع‌تری ارائه می‌دهند، اما گاهی اوقات حساسیت و ویژگی ویژه ای ندارند.

پایگاه خبری سما

روش کشت میکروبی، که به عنوان ” روش طلایی یا  Golden Standard” در نظر گرفته می شود، امکان بررسی in-vivo و in- vitro  پاتوژن های میکروبی را فراهم می کند و درک تنوع میکروبی و بیماری را افزایش می دهد. همچنین امکان مطالعه حساسیت باکتریایی به آنتی بیوتیک ها که برای توصیه درمان ضروری است را فراهم می کند. با این حال، این روش دارای محدودیت هایی ازجمله زمان بر بودن (حدا قل نیاز به 2-1روز برای رشد باکتری ها) و نیاز به منابع و ابزار گران قیمت است ، که آن را برای موقعیت هایی که نیاز به نتایج سریع دارند، ناکافی می کند.

آزمایش‌های بیوشیمیایی پاتوژن‌های باکتریایی را با ارزیابی فعالیت‌های بیوشیمیایی آن‌ها شناسایی می‌کنند، اما دارای محدودیت‌هایی در ویژگی و قابلیت اطمینان بودن آنها به‌ویژه برای پاتوژن‌های خنثی ازنظر بیوشیمیایی هستند. تکنیک‌های ایمونولوژیک مانند ELISA  و  IMS، حساسیت بالاتر و تجزیه و تحلیل سریع‌تری ارائه می‌دهند، اما همچنان نیازمند اطلاع رسانی فرهنگی هستند. ترکیب این تکنیک ها با روش های دیگر باعث افزایش دقت تشخیص و کاهش زمان می شود.

روش های مولکولی

روش‌های مولکولی برای تشخیص پاتوژن حساس‌تر و خاص‌تر از تکنیک‌های سنتی هستند. این روش‌ها بخش‌های خاصی از ماده ژنتیکی پاتوژن را هدف قرار داده و تقویت می‌کنند و امکان شناسایی دقیق را حتی در غلظت‌های پایین فراهم می‌کنند. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک پرکاربرد است که اسیدهای نوکلئیک را از طریق چرخه حرارتی تقویت می‌کند و امکان تشخیص توالی‌های DNA خاص را فراهم می‌کند. Real-time PCR با نظارت مداوم تکثیر DNA و ارائه نتایج کمی، این امر را بیشتر تقویت می دهد.

روش‌های تکثیر هم دما مانند تکثیر هم‌دمای متصل به حلقه یا تکثیر ایزوترمال متصل به حلقه (LAMP) ، تقویت اسید نوکلئیک سریع و اختصاصی را بدون چرخه حرارتی ارائه می‌دهند، و آنها را برای مواقعی که منابع محدود است، مناسب می‌سازد. تقویت مبتنی بر توالی اسید نوکلئیک (NASBA) تکنیک دیگری است که عمدتاً برای تشخیص RNA استفاده می شود، که RNA را در دمای ثابت تقویت می کند و امکان شناسایی سریع و حساس پاتوژن های زنده را فراهم می کند. علیرغم مزایای آنها، این تکنیک های مولکولی می توانند با خطرات آلودگی، هزینه و نیاز به تجهیزات تخصصی و پرسنل آموزش دیده محدود شوند.

فناوری های جدید و نوظهور

توالی‌یابی نسل بعدی متاژنومیک بدون سلول‌های پلاسما (cf-mNGS) به عنوان یک ابزار تشخیصی محوری در عمل بالینی در حال ظهور است و از محدودیت‌های روش‌های مبتنی بر تشخیص سنتی فراتر می‌رود. با تعیین توالی قطعات DNA میکروبی و بدون سلول انسانی در پلاسما به طور همزمان، cf-mNGS  از بیوانفورماتیک پیشرفته برای شناسایی طیف گسترده ای از پاتوژن ها، از جمله باکتری ها، ویروس های  DNA، قارچ ها و انگل ها، بدون فرض قبلی در مورد عامل ایجاد کننده استفاده می کند. این رویکرد غیر تهاجمی، حساسیت و ویژگی استثنایی را ارائه می‌کند، و آن را به ویژه در مواردی که تشخیص‌های مرسوم مشکل دارند، مانند عفونت‌های ارگانیسم‌های پیچیده یا موقعیت‌هایی که بیمار تحت تأثیر درمان‌های ضد میکروبی قبلی هستند، ارزشمند می‌کند.

در مقایسه با روش‌های مبتنی بر کشت که ساده تر هستند، حسگرهای زیستی یا Biosensors ابزارهای پیشرفته‌ای هستند که برای تشخیص سریع پاتوژن ضروری هستند. آنها از نظر حساسیت و ویژگی برتر هستند و مستقیماً پاتوژن ها را بدون آماده سازی گسترده شناسایی می کنند. به طور معمول، آنها از یک عنصر شناسایی زیستی – مانند آنتی بادی ها یا اسیدهای نوکلئیک – و یک مبدل،  تشکیل شده اند که فعل و انفعالات را به سیگنال های قابل اندازه گیری تبدیل می کند. حسگر ایمپدیمتریک بدون برچسب (Impedimetric biosensors  label-free) که به دلیل عملکرد قابل توجه هستند، از تغییرات امپدانس  (مقاومت الکتریکی) برای تشخیص رویدادهای اتصال الکترود استفاده می کنند.

آنها امواج سینوسی ولتاژ کم دامنه را در فرکانس ها برای اندازه گیری امپدانس اعمال می کنند و مقاومت در برابر جریان الکترون را منعکس می کنند. این روش که با پوشش‌هایی مانند تک‌لایه‌های خود مونتاژ شده تقویت می‌شود، تثبیت گیرنده زیستی پایدار و تشخیص دقیق پاتوژن را تضمین می‌کند، که نمونه‌ای از آن در کاربرد شناسایی های سودوموناس آئروژینوزا، استرپتوکوکوس پیوژنز و استافیلوکوکوس اورئوس است.

فناوری لیزر فمتوثانیه ( Femtosecond laser technology ) به طور فزاینده ای به دلیل پتانسیل آن در تشخیص میکروبیولوژی و پاتوژن شناخته می شود و قابلیت های بی سابقه ای را برای تشخیص سریع و دقیق ارائه می دهد. با استفاده از طیف‌سنجی فلورسانس القا شده با لیزر فمتوثانیه (LIF)، محققان می‌توانند به طور موثر باکتری‌هایی مانند E. coli و Enterococcus faecalis را بر اساس طیف‌های نشر فلورسانس متمایزشان نظارت و تمایز دهند.

این رویکرد از پالس های لیزر فوق سریع برای تحریک فلورسانس در نمونه های میکروبی استفاده می کند. این تکنیک شناسایی سریع پاتوژن ها را امکان پذیر می کند و بینش های ارزشمندی را در مورد ویژگی های طیفی و طول عمر فلورسانس آنها ارائه می دهد. علاوه بر این، لیزرهای فمتوثانیه، اثرات انتقال حرارت را به دلیل مدت زمان پالس بسیار کوتاه خود به حداقل می‌رسانند و از حداقل آسیب به ناحیه تحت تابش و حفظ یکپارچگی نمونه اطمینان می‌دهند. بنابراین، روش‌های مبتنی بر لیزر فمتوثانیه برای پیشبرد تشخیص‌های میکروبیولوژیکی با حساسیت و دقت بالا امیدوارکننده هستند.

با پیشرفت فناوری و افزایش تقاضا برای تشخیص سریع و دقیق میکروارگانیسم‌ها، روش‌های سنتی همچنان جایگاه خود را در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی حفظ کرده‌اند، اما محدودیت‌هایی نظیر زمان‌بر بودن و نیاز به تجهیزات گران‌قیمت دارند. روش‌های مولکولی و فناوری‌های نوظهوری امکانات جدیدی برای شناسایی سریع، حساس و خاص پاتوژن‌ها ارائه می‌دهند. با این حال، هزینه‌های بالای تجهیزات و نیاز به پرسنل متخصص همچنان چالش‌هایی را برای پذیرش گسترده این تکنیک‌ها به وجود می‌آورد.

سرمایه‌گذاری در توسعه و تجاری‌سازی این فناوری‌ها، به ویژه در کشورهای در حال توسعه، می‌تواند به کاهش هزینه‌ها و افزایش دسترسی به تشخیص‌های سریع و دقیق کمک کند. با بهبود تکنولوژی و کاهش هزینه‌ها، انتظار می‌رود که این روش‌ها به طور گسترده‌تری در سیستم‌های بهداشتی مورد استفاده قرار گیرند، که بهبود تشخیص و درمان بیماری‌ها و کاهش هزینه‌های کلی مراقبت‌های بهداشتی را به دنبال خواهد داشت.

هلدینگ بین المللی سما